توالی یابی ترانس کریپتوم با ISO-Seq/PacBio

شرح خدمت

"توالی‌یابی ایزوفرم" (Iso-seq) که توسط Pacific Biosciences (PacBio) توسعه یافته است، مبتنی بر فناوری توالی‌یابی خوانش بلند بوده و امکان شناسایی ایزوفرم‌های جدید با دقت فوق العاده را برای محققان میسر می سازد.

توالی‌یابی RNA به متداول‌ترین روش ارزیابی پروفایل بیان ژن برای اکثر محققان این حوزه تبدیل شده است. با این‌حال، به دست آوردن تصویری کامل از ترنسکریپتوم دشوار است، زیرا خوانش های کوتاه نمی توانند رونوشت‌های پیچیده را به دقت سرهم (مونتاژ) assemble کنند.

پلتفرم Iso-Seq توالی‌های cDNA با طول کامل ایجاد کرده (از انتهای 5’ رونوشت‌ها تا  دنباله poly-A) و نیاز به بازسازی رونوشت با استفاده از الگوریتم‌های استنتاج-ایزوفرم را حذف می‌کند. روش Iso-Seq اطلاعات دقیقی در مورد اگزون‌های با پیرایش متناوب و جایگاه های شروع رونویسی ارائه می‌دهد. همچنین، اطلاعاتی در مورد جایگاه های پلی-آدنیلاسیون رونوشت‌ها در سراسر مکمل ایزوفرم‌های درون ژن‌های هدف یا کل رونوشت‌ها نشان می‌دهد.

جزئیات خدمات کلیدی

• خدمات توالی‌یابی ترنسکریپتوم Iso-Seq/PacBio بر روی پلتفرم Sequel I/II اجرا می‌شوند.
• گزارش‌ها و فایل‌های داده خروجی در فرمت‌های استاندارد ارائه می‌شوند: داده‌های BAM، .xls، png. و FASTQ.

استانداردهای توالی‌یابی

20 گیگابایت داده توالی‌یابی در هر نمونه توصیه می‌شود.

تجزیه و تحلیل داده‌ها

• گزینه‌های تجزیه و تحلیل داده‌های تمیز، استاندارد و سفارشی موجود است.
• خدمات ذخیره‌سازی داده‌ها و کاربردهای بیوانفورماتیک، در صورت درخواست، موجود است.

الزامات نمونه

توصیه شده:

جرم: ≥ 3 µg

غلظت: ≥ 285ng/µL

RIN ≥7.5

28S/18S(23S/16S) ≥1.2

ضروری:

1.5µg ≤ m < 3 µg

RIN ≥7.5

28S/18S(23S/16S) ≥1.2

مدت زمان ارائه خدمات

معمولاً 40 روز کاری از زمان پذیرش کنترل کیفیت (QC) نمونه تا  تحویل داده‌های توالی‌یابی.

نکات برجسته در خصوص Iso-Seq

1) کمی سازی کامل با فناوری UMI.

ما می‌توانیم RNA کل، خون کامل، لاین سلولی، نمونه‌های بافت منجمد تازه را با شرایط کلی زیر پردازش کنیم: هر رونوشت اصلی با یک شناسه مولکولی منحصربه‌فرد (UMI)، که شامل 6-8 باز تصادفی است، نشاندار می‌شود. شمارش تعداد نسخه رونوشت‌ها با رویکرد مبتنی بر UMI، تعیین کمیت دقیق ایزوفرم را بدون تداخل تکرار توالی‌یابی ممکن می‌سازد. فناوری UMI براساس فرآِیند های کاری مبتنی بر توان عملیاتی چندگانه Iso-Seq و polyA ISO-Seq طراحی شده است. فناوری UMI و روش  لیگاسیون متوالی چند درجی (multi-insert sequential ligation) توسط شرکت BGI ثبت اختراع  شده است.

2 ）شناسایی رونوشت های بیشتر با Iso-Seq چند توانی (یا توان عملیاتی چندگانه) (Multi-throughput Iso-Seq)

در مقایسه با Iso-Seq استاندارد، Iso-Seq چند توانی می‌تواند 3-5 برابر خوانش موثر بیشتر ایجاد کرده و امکان شناسایی دو برابری رونوشت‌ها را در حجم یکسان داده‌های توالی‌یابی برای کاربران فراهم می سازد.

ملاحظات: مقدار کل داده‌های توالی‌یابی به شرح زیر است: UHRR-9.47 Gb (Iso-Seq استاندارد)؛ 9.57 Gb (Iso-Seq چند توانی)؛ Maize-11.04 G (Iso-Seq استاندارد)؛ 19.3 Gb (Multi-throughput Iso-Seq).

خوانش‌های پلیمراز: تعداد پلیمرازها، خوانش هایی با کیفیت بالا ایجاد می کنند. سپس، خوانش‌های پلیمراز، برای حفظ نواحی با کیفیت بالا (که شامل باز‌های آداپتورها و passهای تک یا چندگانه در اطراف یک الگوی حلقوی)، اصلاح می‌شوند.

خوانش های موثر: هر مولکول الگوی cDNA به عنوان یک "درج (اضافه)" در نظر گرفته می‌شود و هر pass از درج (اضافه) را یک خوانش موثر می‌نامند. یک خوانش پلیمراز Multi-throughput Iso-Seq، می‌تواند حاوی بیش از یک درج (اضافه) منحصر به فرد باشد.

3）تجزیه و تحلیل طول PolyA با polyA Iso-Seq

اهمیت طول دنباله polyA در فعالیت بیان ژن، در مطالعات مختلف گزارش شده است. خدمت polyA Iso-Seq، اطلاعات تکمیلی از توالی polyA، مانند توزیع طول polyA، فراوانی وقوع سایر بازها در polyA و همبستگی بین طول polyA و بیان ژن را فراهم می‌کند.