توالی یابی RNA یا RNA Sequencing

شرح خدمت

توالی‌یابی RNA، که گاهی به‌عنوان توالی‌یابی ترنسکریپتوم نیز از آن نام برده می‌شود، برای مشخص کردن حضور، کمیت و ساختار RNA در نمونه زیستی در شرایط خاص به کار می رود. در مقایسه با سایر روش‌های تعیین میزان RNA مبتنی بر هیبریداسیون (مانند تجزیه و تحلیل ریزآرایه)، تشخیص ترنسکریپتوم مبتنی بر توالی‌یابی می‌تواند بیان ژن را با پیشینه کم، دقت و سطح تکرارپذیری بالا در یک محدوده‌ بزرگ دینامیک تعیین کند. علاوه‌بر‌این، توالی‌یابی ترنسکریپتوم نیازی به دسترسی به توالی ژنوم  نداشته و می‌تواند واریانت های پیرایشی (splice variants) و ژن‌های همجوشی (fusion genes) را که توسط میکروآرایه‌ها قابل شناسایی نیستند، تشخیص دهد.

تجربه، مقیاس توالی‌یابی و فناوری اختصاصی ما، امکان تحویل سریع داده‌های RNA با کیفیت بالا و قیمت رقابتی در این در مقایسه با سایر مجموعه های فعال در این حوزه، را فراهم می‌کند. همین امروز برای آگاهی از اطلاعات تکمیلی با ما تماس بگیرید.

 مزایا

برای ارائه نتایج بهینه، پلتفرم‌ها/فناوری‌های DNBSEQ (DNBSEQ Technology) استفاده می‌شوند:

• تجزیه و تحلیل پروفایل کل ترنسکریپتوم در همه گونه‌ها: جامع‌ترین تجزیه و تحلیل ترنسکریپتوم در همه گونه‌ها، بدون نیاز به پروب های اختصاصی و ژنوم مرجع.
• پوشش بالا: سیگنال دیجیتال و تعیین مستقیم تقریباً تمام توالی قطعات رونوشت ها.
• دامنه تشخیص وسیع: کمی سازی دقیق چندین تا صدها هزار نسخه و شناسایی نسخه‌های نرمال و نادر.
• وضوح بالا: تشخیص تفاوت‌های تک بازی ناشی از آلل‌های خانواده‌های ژنی و پیرایش دگرسان (alternative splicing).
• سیگنال دیجیتال: تعیین توالی مستقیم تمامی قطعات توالی رونوشت ها، وضوح در سطح تک باز، و فقدان مشکل مرتبط با واکنش‌های متقابل و اختلال پس‌زمینه ناشی از هیبریداسیون متقابل Tiling array متداول.

فواید کتابخانه‌های رشته‌ای

کتابخانه‌های رشته‌ای مزایای قابل توجهی نسبت به کتابخانه‌های غیررشته‌ای دارند، از جمله:

• امکان تشخیص بیان پادمعنا (antisense).
• کمی سازی دقیق‌تر رونوشت‌های همپوشان.
• کشف رونوشت‌های جایگزین، ژن‌های همجوشی و بیان اختصاصی آللی با ضریب اطمینان بالاتر.
• افزایش ضریب اطمینان در تفسیر زیستی رونوشت ها.
• افزایش نرخ نقشه یابی.

جزئیات خدمات کلیدی

• گزارش‌ها و فایل‌های خروجی داده در فرمت‌های استاندارد متداول تحویل داده می‌شوند: داده‌هایBAM ، .xls ، .png و FASTQ.

استانداردهای توالی یابی

• تضمین بالای 80 درصد از بازها با نمره کیفیت ≥ Q30.
• دسترسی به گزینه‌های توالی یابی دو طرفه (Paired-end)100bp و 150bp.
• بیش از 30 میلیون خوانش در هر نمونه توصیه می‌شود.

الزامات نمونه

انسان/موش/ موش صحرایی (خون غیر کامل)

• RNA کل: ≥ 200 ng
• غلظت: ≥ 10 ng/μl
• الزامات کیفیت عمومی: RIN: ≥ 7.0, 28S/18S: ≥ 1.0

 خون کامل انسانی

• RNA کل: ≥ 500 ng
• غلظت: 40-1000 ng/μl
• الزامات کیفیت عمومی: RIN: ≥ 7.0, 28S/18S: ≥ 1.0

 حیوانات، به استثناء انسان/موش/ موش صحرایی

• RNA کل: ≥ 1 μg
• غلظت: 40-2500 ng/μl
• الزامات کیفیت عمومی: RIN: ≥ 7.0, 28S/18S: ≥ 1.0

 گیاه

• RNA کل: ≥ 1 μg
• غلظت: 40-2500 ng/μl
• الزامات کیفیت عمومی: RIN: ≥ 6.0, 28S/18S: ≥ 1.0

 حشرات

• RNA کل: ≥ 1 μg
• غلظت: 40-2500 ng/μl
• الزامات کیفیت عمومی: RIN: ≥ 6.0, 28S/18S: ≥ 1.0

قارچ

• RNA کل: ≥ 1 μg
• غلظت: ≥ 40 ng/μl.
• الزامات کیفیت عمومی: RIN: ≥ 6.5, 28S/18S: ≥ 1.0

توجه: لازم به ذکر است، امکان پردازش نمونه‌های تخریب شده با آستانه‌های کیفی پایین‌تر نیز وجود دارد. برای اطلاعات بیشتر با ما تماس بگیرید. 

مدت زمان ارائه خدمات

• 25 روز کاری، از زمان پذیرش کنترل کیفیت (QC) نمونه تا دسترسی به داده‌های خام فیلتر شده.
• برای پروژه‌های فوری، امکان ارائه خدمات سریع تا 18 روز کاری نیز وجود دارد.
• امکان تسریع در ارائه خدمات وجود دارد. برای جزئیات بیشتر با ما تماس بگیرید.

سوالات متداول

س1: تفاوت بین ساخت کتابخانه mRNA رشته‌ای و غیررشته‌ای چیست؟

ج1: مهمترین تفاوت‌های بین کتابخانه mRNA رشته‌ای و غیررشته‌ای در زیر ذکر شده است:

(1) در مرحله سنتز رشته دوم cDNA، به‌جای dTTP، از dUTP استفاده می‌شود.

(2) در مرحله PCR، پیش از تکثیر PCR، رشته علامت گذاری با dUTP به صورت انتخابی توسط Uracil DNA-glycosylase (UDG) تخریب می‌شود. رشته باقیمانده، برای تولید کتابخانه cDNA مناسب توالی‌یابی، تکثیر می گردد.

س 2: تفاوت در الزامات نمونه، مقدار داده توصیه شده و شرایط تجزیه و تحلیل بین توالی‌یابی رونوشت رشته‌ای و غیررشته‌ای چیست؟

ج 2: این نمونه ها از این منظر یکسان هستند. اگرچه، اصطلاحات تجزیه و تحلیل در ارتباط با نقشه یابی ژنوم و محاسبه پارامترهای تجزیه و تحلیل سطح بیان ژن کمی تا اندازه ای متفاوت می باشد. بنابراین، پیش از تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک (از جمله de novo و resequencing)، تحلیلگران بیوانفورماتیک باید به روش ساخت کتابخانه (کتابخانه mRNA رشته‌ای یا غیررشته‌ای) توجه کنند تا بر اساس آن پارامترهای تجزیه و تحلیل صحیح تنظیم شود. علاوه براین، نسبت تفکیک بازها در کتابخانه RNA رشته‌ای کمی بیشتر است. این، نتیجه ویژگی تجزیه و تحلیل کتابخانه RNA رشته‌ای به شمار می رود.

س 3: کدامیک ازانواع کتابخانه‌ها، برای توالی‌یابی ترنسکریپتوم با استفاده DNBSEQ (فناوری DNBSEQ) توصیه می شود، و تفاوت بین این نوع  کتابخانه‌ها چیست؟

ج 3: برای اهداف تحقیقاتی مختلف، از انواع متفاوتی از کتابخانه‌ها استفاده می شود. گونه‌های مختلف، پروتکل‌ها/کیت‌های مختلفی دارند. همیشه به یاد داشته باشید: نمونه‌های با کیفیت بالا، کتابخانه‌های مناسب و نتیجتاً توالی‌یابی دقیق. کتابخانه استاندارد مدل، کتابخانه mRNA رشته‌ای است که از غنی‌سازی mRNA مبتنی بر polyA استفاده می کند. سایر انواع کتابخانه RNA، معمولاً شامل غنی سازی مبتنی بر PolyA و روش depletion rRNA هستند.