توالی یابی RNAهای غیر کد کننده با طول بلند (Long Non-Coding RNA Sequencing)

شرح خدمت

RNAهای غیرکد کننده زنجیره بلند (که از این پس به RNAهای غیرکد کننده بلند، lncRNA اطلاق می شود)، RNAهایی هستند که طول آن‌ها بیشتر از 200nt بوده و در کد کردن پروتئین دخیل نیستند. آنها در شرایط in vivo به طور گسترده‌ای توزیع شده‌اند و در فرآیند‌های مختلف زیستی، از جمله اپی‌ژنتیک، تنظیم رونویسی و تنظیم پس از رونویسی و دیگر فعالیت های حیاتی مهم نقش دارند. ازآنجایی که بیشتر lncRNAها فاقد ساختار دنباله polyA هستند، روش متداول RNA-Seq با استفاده از دانه های مغناطیسی Oligo dT magnetic bead برای غنی‌سازی polyA ، نمی‌تواند اطلاعات جامعی را در مورد lncRNA ایجاد کند. توالی‌یابی RNA غیرکد کننده بلند (lncRNA-Seq)، یک روش تحقیقاتی است که از رویکرد ویژه مانند Ribo-Off Series Kit استفاده می‌کند، تا ابتدا rRNA نمونه را کاهش داده، سپس کتابخانه را بر اساس RNA غنی شده می‌سازد، در نهایت تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک را بر روی خروجی داده‌های توالی‌یابی با بازدهی بالا انجام می‌دهد. بنابراین، اطلاعات lncRNA در فرآیندهای زیستی خاص (مانند  نمو، بیماری و غیره)، می‌تواند به طور کامل و دقیقی به دست آید.

تصور بر اینست که RNAهای غیرکد کننده بلند (lncRNAs) در انسان در حدود 30،000 رونوشت مختلف را در برمی گیرد، از این رو، رونوشت‌های lncRNA بخش عمده‌ای از ترنسکریپتوم غیرکد کننده را تشکیل می‌دهند. کشف lncRNA کماکان در مرحله اولیه است و تاکنون تنها بخش کوچکی از lncRNAs مورد بررسی قرار گرفته است. اگرچه می‌توانیم، طبقه‌بندی انواع مختلف عملکردهای lncRNA را آغاز کنیم؛ اما توانایی پیش‌بینی عملکرد lncRNAهای جدید، همچنان دور از توانمندی های ما است.

ما به‌عنوان یکی از راه‌های کشف عملکرد lncRNA، بررسی پروفایل بیان را ارائه می‌دهیم. شناسایی lncRNAهایی که در طول رشد و نمو یا در موقعیت‌های خاص به طور متمایزی بیان می‌شوند، می‌تواند عملکردهای بالقوه آنها را روشن سازد. از طرف دیگر، جستجوی lncRNAها و ژن‌های کدکننده پروتئینی که بیان آنها با یکدیگر همبستگی دارد، می‌تواند تنظیم همزمان یا عملکردهای مرتبط را نشان دهد.

در مقایسه با تحقیقات صورت گرفته  پیرامون توالی کدکننده پروتئین و توالی RNA کوچک، پژوهش های انجام شده در خصوص lncRNA در مرحله جدید توسعه خود قرار دارد، به طوری که عملکرد و مکانیسم تنظیمی آن باید در آینده بیشتر روشن شود. نتایج تحقیقات اخیر طیفی از عملکردهای زیستی مولکولی lncRNA؛ مانند تنظیم الگوهای رونویسی، تنظیم فعالیت پروتئین، تغییر الگوی پیرایش RNA و غیره را نشان می‌دهد. این حوزه‌های تنظیمی هنوزدر این زمینه‌ جدید هستند. lncRNAها بعد از mRNA و microRNA کانون توجه مهمی در زمینه ژنومیک عملکردی به شمار می روند. تحقیقات در زمینه lncRNA پتانسیل بازاری بالایی دارد. روش مرسوم در تحقیقات lncRNA مانند هیبریداسیون in situ، فناوری بیش بیانی over-expression، فناوری خاموش کردن ژن به واسطه siRNA و real-time quantitative PCR، خصوصاً از نظر کارائی توالی هدف، دارای محدودیت هایی هستند. فناوری ریزآرایه lncRNA، اگرچه سرعت پیشرفت بالایی دارد، اما محدودیت های آشکاری نیز نشان می دهد: ریزآرایه برای گونه های خاصی طراحی شده، به‌طورکلی نسخه‌ کاربردی آن تنها به موش‌ها و برخی از گونه‌های دیگر محدود است؛ علاوه براین، محدودیت تعداد توالی lncRNA شناخته شده پوشش پروب‌ها در طراحی ریزآرایه را محدود کرده، تجزیه و تحلیل جامع lncRNA را با چالش مواجه می کند؛  ازاینرو، توالی های lncRNA جدید را نمی توان به وسیله این تراشه شناسایی و پیش بینی کرد. نسل جدید فناوری توالی‌یابی با بازدهی بالا به همراه ابزارهای پیش‌بینی بیوانفورماتیک، روشی کارآمدتر را برای کشف lncRNA با عملکردهای تنظیمی تعیین کننده ارائه داده است، به طوری که محققان می توانند از این فناوری در تسریع فعالیت های تحقیقاتی خود استفاده کنند.

 مزایا

• همبستگی بالای بیان mRNA و تکرارپذیری ساخت کتابخانه (مقدار Pearson ≥ 0.90)
• دسترسی به تقریباً تمام اطلاعات lncRNAها در یک run توالی‌یابی منفرد
• تجزیه و تحلیل lncRNAهای شناخته شده و پیش بینی lncRNAهای جدید
• قابل استفاده برای همه گونه‌های یوکاریوتی (lncRNA-seq برای گونه‌هایی غیر از انسان و موش به صورت پروژه سفارشی قابل انجام است).

جزئیات کلیدی خدمات

گزارش‌ها و فایل‌های داده خروجی در فرمت های استاندارد متداول ارائه می‌شوند: داده‌های BAM، .xls، png. و FASTQ.

استانداردهای توالی‌یابی

• تضمین ≥80 درصد بازها با امتیاز کیفی ≥Q30.
• ≥8 Gb داده توالی‌یابی در هر نمونه توصیه می‌شود.

الزامات نمونه

انسان / موش / موش صحرایی / خون غیر کامل:

RNA کل: ≥ 200ng

غلظت: ≥ 20ng/μl

الزامات عمومی کیفیت: RIN ≥ 7.0

مدت زمان ارائه خدمات

• معمولاً 30 روز کاری از پذیرش کنترل کیفیت (QC) نمونه تا دسترسی به داده‌های فیلتر شده.
• خدمات سریع در دسترس است، برای جزئیات بیشتر با ما تماس بگیرید.

سوالات متداول

س 1: ما از چه نوع کیت‌های آماده سازی کتابخانه برای RNA بلند-غیرکدکننده در DNBSEQ (DNBSEQ TECHNOLOGY) استفاده می‌کنیم؟

ج 1: ما از پروب‌ها برای حذف rRNA انسان/موش/موش صحرایی و به دنبال آن دستورالعمل استاندارد آماده سازی کتابخانه برای دستیابی به کتابخانه نهایی lncRNA استفاده می‌کنیم.

س 2: چرا برای توالی یابی LncRNA به اطلاعات رشته RNA (stranded) نیاز داریم؟

ج 2: stranded RNA-seq، اطلاعات رشته خوانش را حفظ می‌کند. این ویژگی، امکان، رفع ابهام خوانش ها در ژن‌های رونویسی شده همپوشان از رشته های anti-sense  را میسر ساخته، مقادیر کمی دقیق تری از سطوح بیان ژن را در مقایسه با non-stranded RNA-seq فراهم می کند. از آنجایی که تعداد زیادی از lncRNAها با ژن‌های کدکننده همپوشانی دارند، برای مطالعات lncRNA پروتکل ویژه stranded ضروری است.

س 3: آیا داده های توالی‌یابی lncRNA فقط حاوی توالی‌های lncRNA هستند؟

ج 3: خیر، پروتکل آماده سازی کتابخانه lncRNA، هر دو mRNA و lncRNA را در داده‌های توالی‌یابی پوشش می دهد.

س 4: چه گونه‌هایی را می‌توانیم به وسیله DNBSEQ LncRNA توالی‌یابی کنیم؟

ج 4: برای توالی‌یابی استاندارد lncRNA، تنها موش، موش صحرایی و انسان سازگار هستند. برای سایر گونه‌ها، لطفاً به جزئیات محصول سفارشی مراجعه کنید.