خانه
خدمات
خدمات تحقیقاتی
خدمات تشخیصی
خدمات سلامت شخصی
گیاهی، حیوانی و میکروارگانیسم
سوالات متداول
بلاگ
تماس با ما
اپلیکیشن
ورود
Farsi 
English  English
Farsi  Farsi / فارسی

توالی یابی RNAهای کوچک (Small RNA Sequencing)

شرح خدمت

RNAهای کوچک، نوعی مولکول RNA غیر کد کننده (ncRNA) هستند که طولی کمتر از200 نوکلئوتید دارند. آنها اغلب در خاموش کردن ژن و تنظیم پس از رونویسی بیان ژن دخیل هستند. مقیاس توالی‌یابی و تجربه گسترده ما، خدمات RNA کوچک با کیفیت بالا و سریع را با قیمتی بی رقیب تضمین می کند.

RNA های کوچک، مولکول‌های غیر کدکننده عملکردی مهمی  شامل miRNA (micro RNA)، siRNA (RNA تداخلی کوچک) و piRNA (Piwi-interacting RNA) هستند. آنها به‌عنوان القا کننده خاموشی ژن منحصر به توالی، از جمله RNAi (RNA interfere)، مهار ترجمه، هتروکروماتینی شدن، القای خاموشی ژن، تنظیم انواع فرآیندهای فیزیولوژیک سلول، مانند رشد و نمو سلول، واکنش به تنش و خاموش کردن ترانسپوزون عمل می‌کنند. شناساگر‌های مولکولی منحصربفرد (UMIs)، می‌توانند برای از بین بردن تکرارهای PCR ناخواسته حاصل از یک مولکول منفرد استفاده شوند. فرض براینست که پس از PCR، مولکول‌هایی که UMI مشترک دارند، از یک مولکول ورودی مشابه مشتق شده‌اند. به این ترتیب، شمارش UMI نسبت به تعداد خوانش‌ها نتایج بهتری ارائه می‌دهد که منجر به تخمین‌های دقیق‌تری از بیان کمی RNA کوچک می‌شود. فناوری UMI به‌ویژه برای مشتریانی که روی نمونه‌های کمیاب و گران‌بها تحقیق می‌کنند یا نمونه‌هایی که حاوی RNA کمتری (مانند اگزوزوم) هستند، سودمندتر است.

توالی‌یابی RNA کوچک، از فناوری توالی‌یابی نسل بعدی برای تعیین توالی miRNAها (18-30 نوکلئوتید یا 18-40 نوکلئوتید) در بافتی خاص، در وضعیت فیزیولوژیک ویژه، استفاده می‌کند. سپس، همردیفی داده‌های توالی‌یابی با  با اطلاعاات موجود در پایگاه های اطلاعاتی انجام می شود تا توالی RNA کوچک را شناسایی و تجزیه و تحلیل کنند و خوانش‌ها به‌عنوان rRNA، tRNA، snRNA، snoRNA و miRNA تفسیر گردد. علاوه‌بر‌این، امکان پیش بینی miRNA جدید بر اساس ساختار سنجاق‌سری pre-miRNA و شناسایی ژن هدف miRNA شناخته شده یا miRNA جدید پیش‌بینی‌شده را میسر می کند. با انجام تجزیه و تحلیل مربوط به ژن هدف، مانند هستی شناسی ژن ها GO (gene Ontology) و تجزیه و تحلیل (شبکه های زیستی) pathway network، می‌توان ارتباط بین فنوتیپ و بیان افتراقی شناخته شده miRNA را کشف کرد تا پدیده های فیزیولوژیک مرتبط از جمله زمان گلدهی، رنگ گل، نمو بذر و مقاومت به بیماری، مکانیسم‌های تنظیمی پاتولوژیک و غیره را تشریح کرد. خدمات توالی‌یابی RNA کوچک DNBSEQTM با فناوری اختیاری UMI، داده‌های توالی‌یابی دقیق، مقرون به صرفه و با کیفیت را برای پشتیبانی از برنامه‌های تحقیقاتی دانشگاهی و بالینی در گونه‌های مختلف ارائه می‌دهد.

 

خدمات Unique Molecular Identifiers (UMIs) ما را دریافت کنید

برای از بین بردن تکرارهای PCR ناخواسته حاصل از یک مولکول منفرد، می‌توان از Unique Molecular Identifiers (UMIs) استفاده کرد. فرض بر اینست که پس از انجام PCR، مولکول‌هایی که UMI مشترک دارند، از یک مولکول ورودی مشتق شده‌اند. به این ترتیب، شمارش UMI نسبت به شمارش خوانش‌ها نتایج بهتری ارائه می‌دهد که منجر به تخمین‌های دقیق‌تری از بیان کمی RNA کوچک می گردد. فناوری UMI، به ویژه برای مشتریانی که بر روی نمونه‌های کمیاب و گرانبها تحقیق می‌کنند یا نمونه‌های حاوی RNA کمتر (مانند اگزوزوم‌ها) سودمندتر است. 

 

تاریخچه توالی‌یابی RNA کوچک

Northern blot: اولین روش تشخیص miRNA است که معمولاً برای ارزیابی  اعتبار دیگر روش‌های شناسایی استفاده می‌شود. نقطه ضعف این شیوه، بازدهی کم و حساسیت ضعیف‌تر در آزمایش miRNA های کمیاب است.

Real-time PCR: در این روش از منابع آغازگرهای primer pools رونویسی معکوس چندگانه (RT) برای تکثیر miRNAهای با مقادیر کم و تعیین کمیت انواع miRNA از طریق متمایز ساختن آغازگر معکوس و آغازگر سنتز شده زنجیره دوم استفاده می شود. این شیوه می‌تواند اختصاصیت و بازدهی واکنش و نیز حساسیت تشخیص را با ترکیب همه miRNAها در سیستم multi-RT-PCR بهبود بخشد.

ریزآرایه miRNA: این تکنیک، روشی با بازدهی مناسب در غربالگری miRNA با تکرارپذیری بالا بوده و برای تعیین کمیت نیز مفید است.

سنجش RAKE: سنجش RNA-primed, array-based Klenow enzyme (RAKE) ، که در آن miRNAها به پروب‌های DNA تثبیت شده بر روی یک ریزآرایه هیبرید شده و از آنزیم Klenow به‌عنوان آغازگر در واکنش گسترش (extension) استفاده می‌شوند. این سنجش برای miRNA‌ها دارای حساسیت و اختصاصی بوده و به‌طور ایده‌آل برای تعیین پروفایل سریع بیان همه miRNA‌های شناخته‌شده مناسب است، از اینرو، می‌تواند مزایای منحصربه‌فردی از نظر اختصاصیت نسبت به روش نورترن بلات یا سایر پلت‌فرم‌های پروفایل بیان مبتنی بر ریزآرایه ارائه دهد؛ تعیین پروفایل miRNA: یک روش جدید تشخیص miRNA با کارایی بالا است که می‌تواند مقدار کل miRNA کمتر از میلی‌گرم را بدون تکثیر یا قطعه متمایزکننده تشخیص دهد. این روش، از پروب سنتزی آزمایشگاهی in situ برای انطباق انتخابی miRNA بالغ در توالی و طول بدون جابجایی توالی، استفاده می‌کند، همچنین بازدهی بالا با مقدار کم نمونه را به همراه دارد. از ویژگی‌های تکنیک ریزآرایه یا ریز تراشه فوق الذکر، می توان به بازدهی عملیاتی و کمی‌سازی بالا و مقدار کم نمونه مورد نیاز اشاره کرد، درحالی‌که نقطه ضعف آن پایداری ضعیف کیفیت داده است. علاوه‌براین، دیدگاه جامعی که نشان دهد، آیا داده‌های بیشتر به معنای کیفیت بالای این فناوری آزمایشی با بازده عملیاتی بالا است یا خیر، وجود ندارد.

SQ-PCR: تکنیکی مبتنی بر تکثیر برای تعیین کمیت miRNA (SQPCR، small-target quantitative PCR) است، که میزان اختصاصیت آن تا حدی از عدم انطباق ایجاد شده توسط T4 DNA لیگاز ناشی می‌شود. مرحله رونویسی معکوس، همراه با واکنش اتصال (ligation)، اختصاصیت توالی این سنجش را در نواحی مرکزی و انتهایی 3′ miRNAها، (که مناطق مهمی در تمایز بین اعضای خانواده miRNA هستند)، هدف قرار می‌دهد. این سنجش شامل مجموعه‌ای پشت‌سرهم از زیر واکنش‌های آنزیمی است که در حال حاضر، به طور گسترده در سنجش‌های مختلف اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود. با استفاده از این بیوشیمی قوی، SQ-PCR به راحتی برای کمی‌سازی هر توالی‌ای سازگار بوده و بنابراین، برای کمی‌سازی با حساسیت و بازدهی بالا در miRNAهای اعتبار سنجی شده و فرضی مناسب است.

 

مزایای فناوری

RNA کوتاه، فرصتی را برای ما فراهم می‌کند تا به طور کامل در مورد ترکیب و عملکرد آن در شرایط خاص تحقیق کرده و پایه و اساس miRNA را درک کنیم. RNA کوتاه می‌تواند DGE یا RNA-seq یا degradome را مرتبط ساخته تا بتوان مکانیسم تنظیمی miRNA و ژن‌های هدف آن را مورد بررسی قرار داد. همچنین، امکان تشخیص تقریباً تمامی RNAهای کوتاه، تکرار های مرتبط با RNAهای کوچک و tagهای تخریب شده اگزون‌ها و اینترون‌ها مستقل از اطلاعات شناخته شده را فراهم کند. همچنین، قابلیت شناسایی miRNAهای شناخته شده و پیش‌بینی و تشخیص miRNAهای جدید را به طور همزمان میسر می سازد.

 

جزئیات خدمات کلیدی

  • گزارش‌ها و فایل‌های داده خروجی در قالب‌های فرمت‌های استاندارد متداول ارائه می‌شوند: داده‌های BAM، .xls، png. و FASTQ.

 

استانداردهای توالی‌یابی

  • تضمین کیفیت بالای 85 درصد بازها با امتیاز کیفی ≥Q30.
  • بالای 20 میلیون خوانش در هر نمونه توصیه می‌شود.

 

الزامات نمونه

نمونه‌های معمولی:

  • جرم: ≥ 1μg
  • غلظت: ≥ 50ng/μl
  • حجم: 15 μl

الزامات کیفی عمومی:

  • RIN ≥ 6.5 (گیاه)
  • RIN ≥ 8.0 (انسان/حیوان).

(توجه داشته باشید، امکان پردازش نمونه‌های تخریب شده با مقادیر کیفیت پایین تر نیز وجود دارد. برای اطلاعات بیشتر با ما تماس بگیرید.)

  

Product name

Sample Types

Amount

Quantitative Result (Agilent Bio-analyzer)

Concentration

RIN

28S/18S or DV200

Baseline
and 5S

Sample Purity

DNBSEQ
Small RNA
sequencing

 

Total RNA
(Plant)

m≥1μg

c≥50 ng/μL

RIN≥6.5

28S/18S ≥1.3

The
baseline
is smooth
and 5S
peak is
normal

Not
contaminated
with DNA, protein or salt ions

Total RNA
(Animals)

m≥1μg

c≥50 ng/μL

RIN≥8.0

28S/18S ≥1.5

Total RNA
(insect)

m≥1μg

c≥50 ng/μL

N/A

FFPE RNA

m≥1μg

c≥50 ng/μL

RIN≥2.0

DV200≥30%

N/A

Small RNA
(<200nt)

m≥

m≥100ng

c≥5ng/μL

The detection peaks are mainly
concentrated within 200 nt.

N/A

Small RNA of
plasma/serum/
exosome/RIP

m≥20ng

c≥2ng/μL

The detection peaks are mainly
concentrated within 500nt.

N/A

لطفاً توجه داشته باشید: برای نمونه‌های خاص مانند اگزوزوم‌ها، پلاسما و سایر نمونه‌های با مقدار کم RNA، اکیداً به مشتری توصیه می‌کنیم که در زمان استخراج RNA در آزمایشگاه خود، 1ul RNAse Inhibitor اضافه کنند (توصیه به Enzymatics/RNAse Inhibitor/Y9240L/20000 U).

 

 مدت زمان ارائه خدمات

  • معمولاً 27 روز کاری از زمان پذیرش کنترل کیفیت (QC) نمونه تا دسترسی به داده‌های فیلتر شده.
  • امکان تسریع در ارائه خدمات وجود دارد. برای جزئیات بیشتر با ما تماس بگیرید.

 

سوالات متداول

س 1: چه نمونه‌ای می‌تواند در BGI پذیرش شود؟

ج 1: RNA کل، RNA کوچک بازیافت شده، نمونه بافت، سوسپانسیون لاین های سلولی و غیره.

 

س 2: حداقل مقدار نمونه برای ساخت کتابخانه RNA کوچک، چقدر است؟

ج 2: حداقل مقدار نمونه 100 نانوگرم RNA کل است.

 

س 3: چگونه می‌توان میزان موفقیت ساخت کتابخانه را تضمین کرد؟ استانداردهای QC چیست؟

ج 3: پیش شرط این روش، کیفیت و مقدار RNA کل است. اگر الزامات ذکر شده رعایت شود، میزان موفقیت به 95 درصد می‌رسد. استانداردهای اصلی QC شامل اندازه و غلظت کتابخانه بوده و کتابخانه واجد شرایط به این معنی است که اندازه قطعه وارد شده یا درج (insert) در محدوده تئوری قرار دارد و غلظت نیازهای توالی‌یابی را برآورده می‌کند.

 

س 4: چه مواردی باعث  شکست در مرحله ساخت کتابخانه چیست؟

ج 4: دلایل مختلفی وجود دارد که می‌توان آنها را به دلایل برونی و دلایل درونی تقسیم کرد (علمی و فردی). دلایل علمی عبارتند از: مقدار ناکافی، کیفیت بد، محتوای کم RNA کوچک نمونه‌ها نسبت به محتوای نرمال، و مواردی از این قبیل که عمدتاً مرتبط با خود نمونه است. به‌عنوان مثال، غلظت RNA کوچک در نمونه‌های سرم بسیار کم بوده و مقدار اولیه برخی نمونه‌ها نیز کم است؛ بنابراین، نمونه‌های ذکر شده در بالا می‌توانند منجر به شکست در ساخت کتابخانه شوند. دلایل فردی شامل اشتباه در عملیات (فرآیند) اجرا، مشکل تجهیزات آزمایشگاهی، مشکل  (واکنشگرها) و غیره است که ارتباطی به خود نمونه‌ها ندارد. بر اساس آمار و اطلاعات، تاکنون، میزان موفقیت توانسته به 95 درصد برسد.

 

س  5: راهبرد توالی‌یابی برای RNA کوچک چیست؟ چه مقدار داده به دست خواهیم آورد؟

ج  5: معمولاً، ما SE50 با استفاده از پلت فرم DNBSEQ را برای RNA کوچک اجرا می‌کنیم. 20 میلیون خوانش تصفیه شده در هر نمونه توصیه می‌شود.

 

س 6: آیا برای تجزیه و تحلیل RNA کوچک، به ارائه توالی مرجع توسط همکاران نیاز است؟

ج 6: بله، توالی ژنوم اولویت دارد. اگر توالی ژنوم وجود نداشته باشد، توالی ژنوم یا توالی EST گونه‌های خویشاوند یا نزدیک توصیه می‌شود. علاوه براین، برخی داده‌های دیگر نیز مورد نیاز است. اطلاعات دقیق، به الگوی مرجع RNA کوچک اشاره دارد.

 

س 7: راه تایید بیان افتراقی miRNAها (چیست)؟

ج 7: Stem-loop quantitative real-time PCR، PCR کمی (qPCR)، qRT-PCR

 

س 8: چه نوع نمونه‌هایی برای توالی‌یابی RNA کوچک با فناوری UMI مناسب هستند؟

ج 8: توالی‌یابی RNA کوچک با فناوری UMI را می‌توان در هر نوع نمونه‌ای انجام داد. این فناوری به ویژه برای اگزوزوم‌ها و نمونه‌هایی با مقدار محدود RNA کوچک مناسب است.

 

س 9: در نمونه‌های با مقدار RNA کم، آیا نیاز به افزودن بازدارنده RNAse داریم؟

ج 9: بله، در نمونه‌های خاص مانند اگزوزوم‌ها، پلاسما و سایر نمونه‌های با مقدار کم RNA، ما قویاً به مشتری توصیه می‌کنیم تا هنگام استخراج RNA خود، 1ul RNAse Inhibitor اضافه کنند (Enzymatics/RNAse Inhibitor/Y9240L/20000 U را توصیه می‌کنیم).

 

س 10: انواع نمونه‌های ویژه چیست؟

ج 10: برای انواع نمونه‌های ویژه، مانند RNA استخراج شده از سرم، نمونه‌های پلاسما، نمونه‌های مایع بافتی، نمونه‌های FFPE، اگزوزوم‌ها و RNA با مقدار کم. لطفاً به اطلاعات زیر توجه کنید:

  1. a. هزینه ساخت کتابخانه به دلیل اعمال تیمارهای خاص، بالاتر از انواع نمونه استاندارد است.
  2. b. به دلیل کیفیت غیرمنتظره نمونه و کیفیت کتابخانه، مقدار داده توالی‌یابی تضمین شده نیست و ما توالی‌یابی اضافی‌ای را برای آن کتابخانه به صورت رایگان پردازش نمی‌کنیم.

 

س 11: چرا مقدار داده توالی‌یابی در انواع نمونه‌های خاص تضمین نمی‌شود؟

ج 11: توضیح  تفصیلی:

وقتی 20 میلیون خوانش/نمونه را عرضه می‌کنیم، دستور توالی‌یابی را با 20*1.5=30  میلیون خوانش خام/کتابخانه تنظیم خواهیم کرد. ما انتظار 20 میلیون خوانش/نمونه تمیز در نمونه‌های استاندارد و واجد شرایط داریم. اما برای انواع نمونه‌های خاص (به‌ویژه انواع نمونه‌هایی که گزارش QC با NA در آن‌ها مشخص شده است)، نمی‌توانیم تعداد داده‌های خام و تمیز را تخمین بزنیم، ازاینرو مسئولیت مقدار داده‌های تمیز نهایی را بر عهده نمی‌گیریم. در این مورد، اگر مشتریان نیاز به ارائه داده کافی از BGI دارند، هزینه توالی‌یابی اضافی مورد نیاز است. به‌طور معمول، مگر در موارد خاص یا انواع نمونه خاص، خروجی داده تامین می‌شود.

 

س 12: آیا ما خدمات توالی‌یابی مبتنی بر lane  (توالی یابی خطی) را برای توالی‌یابی RNA کوچک ارائه می‌دهیم؟

ج 12: بله، ما می‌توانیم خدمات توالی‌یابی lane را برای توالی‌یابی RNA کوچک ارائه دهیم، لطفاً توجه داشته باشید که در صورت سفارش این توالی‌یابی، کتابخانه تعادلی اضافی با 15 درصد از توالی‌یابی lane مورد نیاز است. هزینه کتابخانه تعادلی قبلاً در قیمت توالی‌یابیUMI small RNA sequencing-DNBSEQ SE50  محاسبه شده است.